Balai Besar Laboratorium Kesehatan Masyarakat Surabaya

DETEKSI BAKTERI RESISTEN

24 Juni 2020 / By Administrator,

DETEKSI BAKTERI RESISTEN
Oleh dr. Titiek Sulistyowati, M. Ked. Klin, Sp. MK
BBLK Surabaya

Bakteri penyebab infeksi pada manusia telah mengembangkan mekanisme resistensi (kekebalan) terhadap antibiotik yang dulu biasa digunakan untuk mengobati infeksi tersebut¹. Awalnya, sebagian besar Staphylococcus aureus sensitif terhadap penisilin. Setelah satu tahun diperkenalkan, Penisilin dilaporkan telah mengalami resisten pada tahun 1942.² Pertengahan tahun 1940 mekanisme resistensi penisilin terhadap beta-laktamase yang diinduksi telah berhasil diungkap³. Hampir setengah atau lebih strain S. aureus di rumah sakit mengalami resistensi terhadap penisilin pertengahan tahun 1950^4,5. Selain itu, S. aureus mampu mengembangkan resistensi terhadap antibiotik lain seperti eritromisin, streptomisin, dan tetrasiklin.^4,6,7 Sayangnya, sejarah kembali terulang. Metisilin diperkenalkan tahun 1959 untuk mengatasi masalah resistensi penisilin. Namun, 2 (dua) tahun kemudian S. aureus telah dilaporkan mengalami resistensi terhadap metisilin dan disebut sebagai Methiciilin Resistant Sthapylococcus aureus (MRSA).⁸

Resisten didefinisikan sebagai kemampuan sementara atau permanen dari suatu organisme dan keturunannya untuk tetap hidup dan / atau berkembang biak di bawah kondisi yang menghancurkan atau menghambat organisme tersebut. Bakteri dikatakan resisten ketika mereka tidak rentan/sensitif terhadap konsentrasi agen antimikroba yang digunakan.⁹

Ancaman resistensi antimikroba telah menjadi masalah global pada perawatan kesehatan publik. Data Centers for Disease Control and Prevention (CDC) tahun 2013 menunjukkan sekitar 2 (dua) juta orang di Amerika Serikat mengalami infeksi serius dengan bakteri resisten terhadap minimal 1 (satu) antibiotik. Sekitar 23.000 orang meninggal karena infeksi dari bakteri resisten terhadap antibiotik¹⁰. Infeksi yang disebabkan oleh strain bakteri resisten menyebabkan kerugian hingga dua kali lipat dibandingkan dengan infeksi serupa oleh strain sensitif¹¹. Kerugian ini bisa secara klinis (kegagalan pengobatan atau kematian) maupun secara ekonomi (rawat inap makin lama, biaya perawatan makin bertambah). Kerugian besar akan lebih terasa karena keparahan penyakit, virulensi strain bakteri, atau tingkat kerentanan pasien. Bakteri resisten lebih sulit diobati dan membutuhkan dosis lebih tinggi, sehingga keduanya mungkin lebih mahal atau lebih toksik. Bakteri ini menambah komplikasi dan bahkan meningkatkan angka mortalitas¹². Contoh: Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Vancomycin-Resistant Enterococcus (VRE), Multi-Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB), Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae (CRE) pada bakteri usus. Bakteri ini biasa disebut sebagai ‘’superbug’’.

Resistensi terjadi melalui beberapa mekanisme, antara lain: (1) resistensi alami pada jenis bakteri tertentu, (2) mutasi genetik, atau (3) satu spesies yang memperoleh resistensi dari spesies yang lain. Semua bakteri dapat mengembangkan resistensi terhadap antibiotik¹⁰. Salah satu tindakan pencegahan dengan penggunaan antibiotik secara bijak dan rasional. Antibiotik spektrum sempit lebih baik dibandingkan dengan spektrum luas, sehingga bakteri dapat dibunuh secara efektif dan akurat serta tidak menyebabkan resistensi.¹³

Kampanye tentang penggunaan antibiotik dengan tepat menjadi sangat penting. Klinisi perlu mempertimbangkan bahwa patogen tertentu mungkin resisten terhadap beberapa atau semua antibiotik yang tersedia, sehingga uji kepekaan terhadap antibiotik menjadi prosedur standar. Metode uji kepekaan terhadap antibiotik adalah prosedur in vitro yang digunakan untuk mendeteksi resistensi antibiotik pada masing-masing isolat bakteri. Metode deteksi laboratorium ini dapat menentukan resistensi atau kepekaan suatu isolat terhadap antibiotik terapeutik. Hasil uji kepekaan terhadap antibiotik dapat menjadi pedoman klinis yang berguna dalam memilih pengobatan antibiotik terbaik untuk setiap pasien tertentu. Metode yang sama ini juga dapat digunakan untuk memantau adanya dan penyebaran mikroorganisme yang resisten dalam populasi.

Metode uji dalam mendeteksi bakteri resisten terhadap antibiotik
Ada beberapa metode uji kepekaan terhadap antibiotik dengan kelebihan dan kekurangan masing-masing. Semua memiliki tujuan yang sama, memberi prediksi apakah infeksi yang disebabkan oleh isolat bakteri akan merespon terapi dengan antibiotik tertentu. Metode tersebut antara lain:

1. Metode pengenceran (metode dilusi)
Prinsip metode dilusi adalah melarutkan senyawa antibiotik pada media agar atau kaldu dengan berbagai konsentrasi dan ditanami bakteri uji. Selanjutnya diinkubasi semalam dan konsentrasi terendah dari senyawa antibiotik yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri dapat ditentukan. Pengamatan dilakukan untuk melihat kekeruhan pada tabung. Konsentrasi terendah obat pada tabung ditunjukkan dengan hasil biakan yang mulai tampak jernih (tidak ada pertumbuhan mikroba) adalah konsentrasi hambat minimal (KHM). Selanjutnya ditanam pada media agar dan dilihat pertumbuhannya, maka konsentrasi terendah yang tidak terdapat pertumbuhan menunjukkan konsentrasi bunuh minimal (KBM). Apabila KHM telah ditentukan, maka organisme ditafsirkan sebagai bakteri sensitif, intermediate, atau resisten berdasarkan referensi.¹⁴

2. Metode disk difusi
Tes difusi cakram, juga dikenal sebagai tes Kirby - Bauer, telah banyak digunakan di laboratorium klinis sejak tahun 1966. Prinsip uji metode difusi adalah menempatkan cakram kertas yang telah diberi antibiotik dengan konsentrasi tertentu pada media yang telah ditanami organisme uji  secara merata. Penentuan kepekaan antibiotik adalah mengukur diameter zona bening yang terbentuk di sekitar cakram. Zona bening disebut zona hambat. Semakin besar diameter zona hambat, maka semakin kecil nilai KHM dari suatu senyawa. Hasil  juga ditafsirkan sebagai sensitif, intermediate, atau resisten terhadap suatu antibiotik sesuai dengan kriteria yang telah ditetapkan¹⁴.

3. Metode otomatis
Prinsip metode otomatis ini sama dengan metode dilusi, tetapi menggunakan alat otomatis. Alat otomatis memudahkan pengerjaan dan dapat mengeluarkan hasil sesuai standar yang digunakan alat. Alat uji sensitivitas otomatis yang tersedia saat ini merupakan alat dengan pilihan otomisasi yang berbeda. Peralatan komersial otomatis bisa berupa alat pembacaan KHM setelah inkubasi dengan prinsip turbidimetrik, prinsip reaksi biokimia, sistem indikator redox, dan sebagainya. Penggunaan instrumentasi dapat membakukan pembacaan titik akhir dan sering menghasilkan hasil uji sensitivitas dalam periode lebih singkat daripada pembacaan manual karena sistem deteksi optik yang sensitif memungkinkan deteksi terhadap perubahan minimal dalam pertumbuhan bakteri.¹⁵

4. E-test (Uji Epsilometer)
Uji E adalah metode sederhana, akurat dan dapat diandalkan untuk menentukan KHM dengan spektrum luas dari agen infeksi. Metode merupakan gabungan dilusi dan difusi. Prinsip uji E adalah pembentukan konsentrasi gradien antibiotik dalam media agar sebagai sarana untuk menentukan sensitivitas. Strip uji E ditempatkan pada piring agar yang ditanami, kemudian ada pelepasan antibiotik dari permukaan plastik ke permukaan agar. Setelah inkubasi, pertumbuhan bakteri menjadi terlihat, penghambatan simetris sepanjang strip terlihat berbentuk elips. Nilai KHM (µg / ml) yaitu angka pada ujung elips yang memotong strip.¹⁵

5. Uji mekanis spesifik (uji deteksi beta laktamase dan uji kromogenik)
Deteksi bakteri resisten ini menggunakan metode enzimatik. Beta laktamase merupakan suatu enzim yang dapat menginaktifkan molekul beta laktam dengan cara merusak cincin beta laktam secara kimia. Produksi beta laktamase adalah mekanisme signifikan penyebab resistensi terhadap beberapa antibiotik beta laktam pada organisme tertentu, seperti H. influenzae, N. gonorrhoeae, M. catarrhalis, Staphylococcus spp., dan beberapa Bacteroides spp. Uji beta laktamase sederhana dapat dilakukan di laboratorium klinis untuk identifikasi produksi enzim beta laktamase pada organisme ini, dan reaksi positif menunjukkan bahwa antibiotik beta laktam (terutama ampisilin, amoksisilin, dan penisilin) menjadi tidak efektif. Deteksi beta laktamase dapat menggunakan beberapa cara antara lain uji disk cefinase, uji asidimetrik dan iodimetrik berdasarkan penisilin, dan lainnya¹⁵.
Teknologi uji kromogenik didasarkan pada molekul tak berwarna (kromogen), terdiri dari substrat (target aktivitas enzimatik spesifik) dan kromofor. Ketika enzim organisme target membelah konjugat kromogenik yang tidak berwarna, kromofor dilepaskan. Kromofor yang tidak terkonjugasi akan menunjukkan warna khas dan kelarutan yang kurang sehingga membentuk endapan. Perubahan warna inilah yang akan diamati untuk mendeteksi bakteri patogen target. Deteksi bakteri resisten dengan uji kromogenik ini biasa dilakukan untuk uji MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)¹⁶.

6. Metode genotipik seperti metode PCR, real time PCR, hibridisasi
Metode genotipik atau biasa disebut dengan diagnostik molekuler adalah salah satu inovasi terbaru di laboratorium mikrobiologi klinis dan cepat berkembang di banyak laboratorium klinis. Teknik biologi molekuler sekarang digunakan untuk membantu diagnosis penyakit infeksi dikarenakan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Tes diagnostik molekuler juga merupakan alat deteksi cepat mikroorganisme tertentu dan sangat berguna untuk mikroorganisme yang sulit tumbuh pada media kultur (fastidious) atau yang mempunyai waktu tumbuh lama (slow growth). Uji diagnostik molekuler digunakan sebagai jawaban cepat kepada dokter klinisi untuk pilihan pengobatan sehingga menghemat waktu dalam kasus infeksi yang mengancam jiwa.

Metode deteksi bakteri resisten yaitu mendeteksi gen penyandi resistensi pada suatu mikroorganisme dengan PCR (polymerase chain reaction), real time PCR, maupun hibridisasi. PCR merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Teknik dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain. Proses PCR terdiri dari tiga tahap, yaitu denaturasi DNA template, penempelan (annealing) primer, dan polimerisasi (extension) rantai DNA. Penentuan target gen resistensi menggunakan primer forward dan reverse yang spesifik.17 Contoh deteksi bakteri resisten adalah gen mecA pada bakteri MRSA.

Realtime PCR mirip dengan tehnik PCR. Tehnik ini didasarkan pada deteksi fluoresensi yang diproduksi oleh molekul reporter yang meningkat sejalan dengan proses PCR. Hal ini terjadi karena akumulasi produk PCR pada tiap siklus amplifikasi. Molekul reporter dengan fluoresensi meliputi pewarna yang berikatan pada DNA untai ganda atau menggunakan probe spesifik sekuens/sequence specific probes (Molecular Beacons or TaqMan® Probes).  RT-PCR juga dikenal sebagai quantitative PCR (qPCR). Jumlah produk PCR (DNA, cDNA atau RNA) yang relatif sedikit, dapat dihitung secara kuantitatif. Perbedaan real time PCR dan PCR biasa adalah deteksi produk PCR dapat dihasilkan pada fase awal reaksi dari rtPCR, sedangkan PCR biasa hanya menggunakan gel elektroforesis untuk deteksi produk amplifikasi PCR pada fase akhir, tanpa mengetahui jumlah produk PCR yang diekspresikan atau dihasilkan.¹⁷ Contoh, deteksi gen rpoB pada pasien tuberkulosis yang resisten terhadap rifampisin dengan menggunakan teknologi Gene Xpert MTB/RIF.

Hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida yang saling komplementer melalu pasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan suatu keseragaman sekuens. Pasangan DNA–DNA, DNA–RNA, atau RNA–RNA dapat terbentuk melalui proses ini. Hibridisasi DNA–DNA terbentuk dalam Southern blotting, sedangkan hibridisasi DNA–RNA terbentuk dalam Northern blotting. Hibridisasi DNA untuk identifikasi molekul DNA yang spesifik  dari DNA yang telah terdenaturasi memiliki kapasitas untuk bergabung kembali (untuk membentuk kembali pasangan basa di antara utas komplementer).  Hal ini menyebabkan pembentukan molekul hybrid. DNA terdenaturasi dari dua sumber berbeda akan bergabung satu sama lain dalam kondisi sesuai kekuatan ion dan temperature.¹⁷ Contoh, Line Probe Assay menggunakan prinsip hibridisasi untuk deteksi bakteri Mycobacterium tuberculosis MDR (Multiple Drug Resistant).

Bakteri terus berkembang dan mengalami revolusi untuk mempertahankan keberadaan di dunia. Kita harus bertindak mulai dari sekarang jika ingin mengimbangi ancaman bakteri resisten ini terhadap kesehatan masyarakat, ekonomi, dan keamanan nasional bangsa. Para ilmuwan telah memperingatkan kita selama bertahun-tahun bahwa kita harus mengembangkan antibiotik baru. Akan tetapi, perkembangan obat baru kalah cepat dibandingkan resistensi bakteri. Kita harus mampu merespon secara nyata ancaman saat ini dengan lebih luas dan hati-hati yaitu dengan mendeteksi penyebaran bakteri resisten pada manusia dan hewan. Kita juga harus mengembangkan diagnostik yang lebih sensitif dan cepat untuk mendeteksi semua bentuk resistensi antibiotik sehingga lebih efektif memandu pengobatan pasien.
    

REFERENSI :  
1.Munita JM, Arias CA. Mechanisms of Antibiotic Resistance. Microbiol Spectr. 2016 April; 4(2): doi:10.1128/microbiolspec.VMBF-0016-2015.   
2.Rammelkamp M. Resistances of Staphylococcus aureus to the action of penicillin, Proc Soc Exp Biol Med, 1942, vol. 51(pg. 386-9).
3.Bondi A Jr, Dietz CC. Penicillin resistant staphylococci. Proc Soc Exp Biol Med 1945; 60:55–8.
4.Finland M. Emergence of antibiotic-resistant bacteria. N Engl J Med 1955; 253: 909–22; contd. 8.
5.Barber M, Rozwadowska-Dowzenko M. Infection by penicillinresistant staphylococci. Lancet 1948; 2:641–4.
6.Brumfitt W, Hamilton-Miller J. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. N Engl J Med 1989; 320:1188–96. 10.
7.Jessen O, Rosendal K, Bulow P, Faber V, Eriksen KR. Changing staphylococci and staphylococcal infections. A ten-year study of bacteria and cases of bacteremia. N Engl J Med 1969; 281:627–35.
8.Jevons MP. “Celbenin”-resistant staphylococci [letter]. Br Med J 1961; 1:124–5.
9.Cloete TE. Resistance mechanisms of bacteria to antimicrobial compounds. International Biodeterioration & Biodegradation. Volume 51, Issue 4, June 2003, Pages 277-282
10.Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic Resistance Threats in the United States. http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/, (accessed 17 January 2016).
11.Eliopoulos GM, Cosgrove SE, Carmeli Y. The impact of antibacterial resistance on health and economic outcomes Clin Infect Dis, 36 (2003), pp. 1433-1437
12.Friedman ND, Temkin E, Carmeli Y. The negative impact of antibiotic resistance. Clinical Microbiology and Infection. Volume 22, Issue 5, May 2016, Pages 416-422
13.de With K, Allerberger F, Amann S, et al. Strategies to enhance rational use of antibiotics in hospital: a guideline by the German Society for Infectious Diseases. Infection. 2016; 44: 395–439.
14.Soleha, T. U. Uji Kepekaan terhadap Antibiotik. Jurnal Kesehatan Unila, Vol. 5, No. 9: 119 – 123.
15.Mahon CR, Lehman DC, Manuselis G. Textbook of diagnostic Microbiology. 5th edition. 2015. Saunders Elsevier. Missouri.
16.Perry JD, Frediere AM. The application of chromogenic media in clinical microbiology. The Society for Applied Microbiology, Journal of Applied Microbiology 103 (2007) 2046–2055.
17.Brooks GF, Carroll KC, Butel JS, Morse SA, Mietzner TA. Jawetz, Melnick, & Adelberg’s Medical Microbiology. 26th edn. 2013.The McGraw-Hill companies. USA.